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              ELISA試劑盒做試驗(yàn)時(shí)不注意會出現(xiàn)怎樣的差錯(cuò)

              發(fā)布時(shí)間:2012-06-29瀏覽:2420次

                在現(xiàn)在的ELISA試劑盒中,血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。

                  使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是:加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快,無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū),易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。

                  試劑的加入在國產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加,除了要注意滴加的角度外,滴加的速度也很重要,滴加太快,很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象,這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附,從而引起非特異顯色。

                  所以,有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的elisa試劑盒這次測定為陽性,下次測定為陰性,往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。

                  ELISA試劑盒競爭法
                  在競爭法ELISA中,陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量,一般調(diào)節(jié)陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間,此時(shí)反應(yīng)zui為敏感。

                  競爭法ELISA不易用自視判斷結(jié)果,因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異,一般均用比色計(jì)測定,讀出S、P和N的吸光值。計(jì)算方法主要也有兩種,即陽性判定值法和抑制率法。

                  a. 陽性判定值法

                  與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同,但在計(jì)算公式中引入陽性對照A值,現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿,陽性對照中抗HBc含量為125±100u/ml.每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽性對照和3個(gè)陰性對照。測得A值后,先計(jì)算陰性對照A值的平均值(NCX)和陽性對照A值的平均數(shù)(PCX),兩個(gè)平均數(shù)的差(N-P)必須大于一個(gè)特定的數(shù)值(例如0.300),試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對照A值均應(yīng)小于2.000,而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范圍,則棄去,而以另2個(gè)陰性對照重新計(jì)算×NCX;如有2個(gè)陰性對照A超出以上范圍,則該次實(shí)驗(yàn)無效。陽性判定值按下式計(jì)算:

                  陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

                  標(biāo)本A值≤陽性判定值的反應(yīng)為陽性,A>陽性判定值的反應(yīng)為陰性。

                  b. 抑制率法

                  抑制率表示標(biāo)本在競爭結(jié)合中標(biāo)本對陰性反應(yīng)顯色的抑制程度,按下式計(jì)算:

                  抑制率(%)= (陰性對照A值-標(biāo)本A值)×100%/陰性對照A值

                  一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性,<50%為陰性。
               

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