細胞培養(yǎng)技術

1. 冷凍管應如何解凍？ 
　　取出冷凍管后， 須立即放入37 ℃水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。 
2. 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應馬上去除DMSO？
　　除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。 
3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 
　　不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。 
4. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？
　　不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源， 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。 
5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ? 
　　FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。 
6. 培養(yǎng)細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？ 
　　一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞。 
7. 何時須更換培養(yǎng)基？ 
　　視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。 
8. 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 
    除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。 
9. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？ 
　　一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 ℃，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。 
10. 懸浮性細胞應如何繼代處理？
　　一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。 
11. 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
　　欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg （約1,000rpm），5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。 
12. 細胞之接種密度為何？ 
　　依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。 
13. 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
　　動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。 
14. DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 
　　冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即為無菌狀況， *次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。
15. 冷凍保存細胞之方法？ 
　　冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 
　　冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 
16. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度？
　　冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 
17. 應如何避免細胞污染？ 
　　細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。 
18. 如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理？ 
　　加入相應抗生素。直接滅菌后丟棄之。 
19. 支原體（mycoplasma） 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 
　　不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。 
20. 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？ 
　　支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義。 
21. CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？
　　定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

來源：慧穎生物實驗室

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