脂質(zhì)體2000說明書

描述

脂質(zhì)體2000是專門用于將核酸轉(zhuǎn)染進(jìn)入真核細(xì)胞的一種形式，我們提供下列的建議：

在多種細(xì)胞和培養(yǎng)板中都有很高的轉(zhuǎn)染效率。在網(wǎng)上列出的細(xì)胞類型中都獲得了較高的轉(zhuǎn)染效率。

核酸-脂質(zhì)體2000的復(fù)合物可以直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，無論是有血清還是無血清的情況。

轉(zhuǎn)染之后不用移除復(fù)合物或者更換培養(yǎng)液，但是復(fù)合物應(yīng)在轉(zhuǎn)染后4-6h移除。

轉(zhuǎn)染的一些重要指導(dǎo)

DNA轉(zhuǎn)染使用page3

我們建議使用Opti-MEM I reduced serum  培養(yǎng)基來稀釋脂質(zhì)體2000和核酸。

轉(zhuǎn)染時(shí)不要向培養(yǎng)基中加入抗生素。

在實(shí)驗(yàn)過程中要保持一樣的條件

DNA轉(zhuǎn)染

使用下列方法在24孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染DNA進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。對(duì)于其他的板子，可以參考page4.所有的數(shù)量和體積都是基于一個(gè)孔的劑量。準(zhǔn)備復(fù)合物使DNA（ug）：脂質(zhì)體（ul）的比例為1:2到1:3。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度較高可以獲得高的效率，高的表達(dá)水平，以及使毒性降低。條件的選擇很重要。

1. 貼壁細(xì)胞：在轉(zhuǎn)染前一天，向24孔板內(nèi)接種0.5-2*105個(gè)細(xì)胞，使得細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)融合率達(dá)到90-95%。切記使用不含抗生素的培養(yǎng)基。
2. 對(duì)于每一個(gè)轉(zhuǎn)染樣品，按照如下方法準(zhǔn)備復(fù)合物：
   • 使用無血清的培養(yǎng)基將DNA稀釋為50ul，溫和混勻。
   • 使用前混勻脂質(zhì)體2000，然后用培養(yǎng)基將一定量的脂質(zhì)體2000稀釋為50ul。室溫孵育5min。

進(jìn)行到c時(shí)間不超過25min

    C．5min的孵育后，混合稀釋的DNA和稀釋的脂質(zhì)體2000（總體積為100ul）。溫和混勻，室溫孵育20min（溶液呈現(xiàn)云霧狀）。

       混合物在室溫可穩(wěn)定存在6h。

1. 向含有細(xì)胞和培養(yǎng)液的板子中每孔加入100ul的復(fù)合物，通過敲打板子和來回晃動(dòng)使其混合均勻。
2. 細(xì)胞孵育18-48h后可檢測轉(zhuǎn)染情況。培養(yǎng)液可在轉(zhuǎn)染4-6h后更換。
3. 對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞系：傳代細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后以1:10的比例加入新鮮的培養(yǎng)液。第二天加入選擇培養(yǎng)基。

優(yōu)化轉(zhuǎn)染

為了獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低毒性，通過調(diào)整細(xì)胞濃度和DNA:脂質(zhì)體2000的比例來優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。確保細(xì)胞90%的融合，以及DNA(ug)：脂質(zhì)體（ul）比例在1:0.5到1:5。

轉(zhuǎn)染條件的浮動(dòng)

  轉(zhuǎn)染到不同類型的培養(yǎng)板中，脂質(zhì)體2000的，核酸的量，細(xì)胞數(shù)以及合適的培養(yǎng)基量，都在下表中顯示。在96孔板中，建議總體積到50ul