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              細(xì)胞換液、傳代及凍存

              發(fā)布時(shí)間:2015-04-17瀏覽:2483次

              細(xì)胞換液、傳代及凍存

              用10%胎牛 DMEM培養(yǎng)液,37℃ 下置于5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合至80%,用0.25%胰酶消化傳代后接種(細(xì)胞密度5 XlO4)于培養(yǎng)瓶或孔板,待細(xì)胞融合至約70%后用于實(shí)驗(yàn)。

              細(xì)胞株培養(yǎng)方法如下: 

              1.貼壁細(xì)胞換液:

              1)吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。

              2)用1xD-hank`s洗一次。

              3)加入適量的新鮮培養(yǎng)液,接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi),放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

              2.懸浮細(xì)胞換液

              1)吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液放入15ml離心管中離心1500rpm 5min。

              2)細(xì)胞沉淀用1xD-hank`s洗一次。

              3)加入適量的新鮮培養(yǎng)液,接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi),放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

              3.細(xì)胞傳代(貼壁細(xì)胞傳代采用胰酶消化法,常用消化液為0.25%的胰蛋白液)

              1)吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。

              2)用1xD-hank`s洗一次。

              3)加入0.5ml-1ml 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn))。

              4)靜止2-10分鐘(顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測)。

              5)吸去胰蛋白酶液,加入培養(yǎng)基。

              6)用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,形成細(xì)胞懸液。

              7)吸取1/5-1/10細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

              8)加入適量的新鮮培養(yǎng)液,接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi),放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

              4.細(xì)胞凍存:

              1)預(yù)先配制凍存液:90%胎牛血清+10%DMSO

              2)取對數(shù)期生長細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后加入培養(yǎng)液終止胰酶反應(yīng),離心(1500rpm 5min)去上清留沉淀加適量凍存液,用吸管吸打制成細(xì)胞懸液(1 XlO5-5X106/ml)

              3)加入1ml細(xì)胞懸液于凍存管中,密封后標(biāo)記凍存細(xì)胞名稱和凍存日期。

              5.細(xì)胞復(fù)蘇:

              1)從液氮中取出凍存管,迅速投入37度-38度水浴中

              2)使其融化5min內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原液體的10倍以上,低速離心1500rpm 5min

              3)去上清,加入培養(yǎng)液,細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)


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